固相抽出(SPE)

HybridSPE Phospholipid

特長

  • 除タンパクおよび生体試料中のリン脂質を除去が簡単
  • リン脂質の濃縮・回収も可能
  • リン酸系化合物(グリホサート、アミノメチルホスホン酸)の濃縮・回収

HybridSPE-Phospholipidは血漿/血清中のタンパクとリン脂質を選択的に除去するために、除タンパクと固相抽出(SPE)を組み合わせた技術です。 ジルコニアコート粒子がルイス酸-塩基の相互作用に基づき特異的にリン脂質と親和性を示し保持するのを利用して除去し、また対象とする多くの塩基性、中性、酸性化合物を固相抽出の原理を用いて選択的、または非選択的に回収することが出来ます。

ラット血漿精製後のTICクロマトグラム:リン脂質除去の比較

HybridSPE-Phospholipid 50 mg/well :
ウェルに100 μLのラット血漿を添加し、300 μLの 1% ギ酸/アセトニトリル溶液(1:3, v/v)を加える。1分間攪拌/混合し、2分間吸引(-10 in Hg)して溶出させる。

タンパク質沈殿法 :
100 μLのラット血漿と300 μLの 1% ギ酸/アセトニトリル溶液(1:3, v/v)を1分間混合し、3分間遠心分離にかけ(6000 rpm)、上清を得る。

他社 SPE(polymer)60 mg/3 mL :
1 mLのメタノールでコンディショニングし、1 mLの水で平衡化する。200 μLのラット血漿をロードし、5%メタノール溶液で2回洗浄した後、 1 mLのメタノールで溶出する。溶出液を乾固し、0.8 mLの水 : 1% ギ酸/アセトニトリル溶液(1:3, v/v)に再溶解する。

HybridSPE-Phospholipidによるリン脂質除去・濃縮のメカニズム

サンプルマトリックスより弱いルイス塩基は保持されず溶出し、強いルイス塩基(リン脂質)は保持される

 

 

リン脂質(Phospholipid)とオーバーラップする塩基性化合物の回収率

100ng/mL STD 回収率%
  Clonidine
(m/z 230)
Protriptyline
(m/z 264)
Desmethyldiazepam
(m/z 271)
Clomipramine
(m/z 315)
HybridSPE-Phospholipid 96.7% 104.1% 102.6% 97.8%
タンパク質沈殿法 54.5% 44.7% 81.9% 110.9%

リン脂質とオーバーラップする化合物は、リン脂質が残存していると回収率が低下する

リン脂質除去の回収率%への影響比較

ラット血漿へ100ng/mLスパイク 回収率%  
  Ketoprofen Propanolol  
HybridSPE-Phospholipid 82.0% 68.0% 従来より高い回収率を達成
タンパク質沈殿法 58.8% 37.0%  
他社A SPE 78.4% 42.0%  
他社B SPE 76.4% 44.4%  

【LC-MS 分析条件】

instrument: Agilent® 1100 / Q-Trap 3200, Turbo ion spray ESI +
column: Discovery® HS F5, 2.1 mm x 10 cm, 3 µm
mobile phase A: 13 mM ammonium acetate in acetonitrile
mobile phase B: 13 mM ammonium acetate in water
flow rate: 200 µL/min
temp.: 30℃
inj.: 5µL

Step Time(min) A(%) B(%)
0 0.0 75 25
1 2.0 95 5
2 4.5 95 5
3 5.0 75 25
4 7.0 75 25

対象化合物タイプによる除タンパク液/溶出液(サンプルマトリックス)の選択

イオン化可能な官能基がない   塩基性化合物や中性化合物
(例:1級、2級、3級アミン)
  酸性化合物やキレート化合物
(例:-COOH基のある化合物)
  両性イオン化合物
(酸性基と塩基性基の両方)
推奨1:1% ギ酸/アセトニトリル溶液
推奨2:1% ギ酸アンモニウム/メタノール溶液
  推奨1:1% ギ酸/アセトニトリル溶液
推奨2:1% ギ酸アンモニウム/メタノール溶液
  推奨1:1% ギ酸/アセトニトリル溶液
推奨2:0.5% クエン酸/アセトニトリル溶液*
推奨3:200mM 過塩素酸アンモニウム/メタノール溶液
  推奨1:1% ギ酸/アセトニトリル溶液
推奨2:0.5%クエン酸/アセトニトリル溶液*
推奨3:1% ギ酸アンモニウム/メタノール溶液

*注:0.5% クエン酸/アセトニトリル溶液を使う際は、事前にウェルもしくはカートリッジを400μLの0.5% クエン酸/アセトニトリル溶液でコンディショニングしてください。

除タンパク機能なし

  1. 血漿(必要に応じてIS 添加)と除タンパク液(血漿と除タンパク液比 1:3 v/v) を 撹拌/混合(例:ボルテックスで1 分)
  2. 遠心分離を2 ~ 5 分、3000 rpm で行う
  3. 上清をHybridSPE に移して吸引し、溶出液をLC-MS 分析

除タンパク機能付き

  1. HybridSPE に血漿(必要に応じてIS 添加)と除タンパク液を添加(血漿と除タンパク液比 1:3 v/v)
  2. 撹拌/混合(例:ボルテックスで1 分、ピペッティング3~5 回)
  3. 10 inch Hg, 4分以上の吸引(あるいは遠心3000rpm、5分)により溶出液を得、LC-MS分析
HybridSPE-Phospholipid の製品仕様
容量 血漿負荷量 リン脂質除去量
500mg/6mL 1~2mL 1mg
30mg/1mL 30~100μL 100μg
15mg/well 20~40μL 30μg
50mg/well 100~300μL 100μg

リン脂質・リン酸系化合物の溶出液

充填剤に吸着したリン脂質・リン酸系化合物は5% (v/v) NH4OH/ アセトニトリル溶液、あるいは5%(v/v)NH4OH/ メタノール溶液で溶出、回収可能です。
※溶出液調製例:1 mL の28%NH4OH(水酸化アンモニウム水溶液)を4.6 mL のアセトニトリルあるいはメタノールと混合する。

参考文献・Enrichment of Phospholipids in Biological Samples Using HybridSPE-PL By: Xiaoning Lu, Michael Ye, Reporter US Volume 28.3

 

製品案内

製品名 入数 CAT.NO.
HybridSPE 製品
HybridSPE – Phospholipid 96-ウェル プレート, 50 mg/well 1 575656-U
HybridSPE – Phospholipid 96-ウェル プレート, 15 mg/well
少量処理用
1 52794-U
HybridSPE – Phospholipid カートリッジ, 30 mg/1 mL 100 55261-U
HybridSPE – Phospholipid カートリッジ, 100 mg/3 mL 54 52797-U
HybridSPE – Phospholipid カートリッジ, 500 mg/6 mL
多量処理用
30 55267-U
関連製品
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